发布日期：2024-12-16 04:45 点击次数：189
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间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSC)位于骨髓腔内血管周围，通过与局部血管内皮细胞互相作用从而促进血管化发生[1]。而在组织成立研究中，重生组织的收效血管化尤为遑急，可保证局部氧气和养分物资的充足供应，普及成立成果[2]。同期，这种组织成立历程中MSC与内皮细胞间的合作与交互作用在更猛进度上响应了细胞在生物体内的原生情况。MSC和内皮细胞之间的交互作用可通过多种途径达成，苟简分为两类：①波折的细胞间交流神气，即通过分泌可扩散的细胞因子、趋化因子、外泌体等达成细胞间交流[3]，研究者们已关怀此类交流神气多年；②细胞间通过平直斗殴的神气交换相互信息，关于细胞功能也至关遑急[4]。
研究表示，细胞间平直交流可通过漏洞纠合(gap junction)[5]和天真纳米管(tunneling nanotubes，TNTs)[6]等多种途径达成，其中探索基于TNTs的细胞间平直交流是一个相对新兴的研究鸿沟。研究证实，多种哺乳动物细胞具备造成TNTs的才调[7]，其中包括MSC和内皮细胞。TNTs主要由肌动卵白(F-actin)和脂质膜构成，在不同细胞之间构建起一座由细胞膜和细胞质延续而来的疏导“桥梁”[8]。然则，以往TNTs多在二维贴壁培养中被考据，但是该模子并不可精采还原细胞在生物体内的生理景色，因此会出现体内实验难以还原体外实验闭幕的步地。与之比拟，细胞球三维培养模子能提供更具生理代表性的细胞微环境[9]，但TNTs在细胞球三维培养模子中的存在需要进一步的考据，尤其是在三维环境下的不同细胞间。
线粒体是细胞的能源工场，同期在细胞间对话中也起着遑急作用。在组织再生表面中，线粒体正在成为研究焦点。线粒体并不是当作并立和静止的细胞器阐明其作用，它不错沿着细胞骨架通顺，与其他细胞器互动从而转机细胞功能[10]。除此以外，线粒体不错通过TNTs在细胞之间进行滚动，从而增强细胞的生物功能[11-13]。同期，β-catenin计划通路的激活也可改善内皮细胞的活性和增殖效率[14]。家喻户晓，内皮细胞的活性和增殖效率在血管生成中起至关遑急的作用[15-16]。因此，线粒体可能当作“通信员”经TNTs介导细胞间交流从而调控MSC和内皮细胞功能。
本研究领先解说三维共培养细胞球模子中MSC和脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)间存在TNTs；再考据TNTs介导的细胞间线粒体交流的发生；从而评价该历程对细胞球血管造收遵守的影响，并初步探索潜在的作用机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物与试剂4周龄雌性SD大鼠5只。RPMI1640王人备培养基和胰卵白酶购自Sigma公司，胎牛血清(FBS)购自AusGeneX公司，琼脂糖购自索莱宝公司，微丝解聚试剂CytoD购自MCE公司，鬼笔环肽染色液、Triton X-100、线粒体膜电位检测试剂盒、细胞膜绿色荧光染色试剂盒(DiO)、细胞膜红色荧光染色试剂盒(Dil)购自碧云天公司，小鼠抗CD31一抗购自好意思国Santa Cluz公司，驴抗兔荧光二抗、驴抗小鼠荧光二抗购自中杉金桥公司，细胞膜染色试剂盒(PKH26)购自赛默飞公司，mGFP-重组腺病毒、mRFP-重组腺病毒、pHBmTur-Mito重组腺病毒购自汉恒公司，兔抗β-catenin一抗购自好意思国CST公司，鼠抗GAPDH一抗购自义翘神州，Western blot抗小鼠二抗和抗兔二抗购自中杉金桥公司，Matrigel基质胶购自BD公司。本研究经重庆医科大学附属口腔病院伦理委员会批准[2020年伦审(063)号]。
1.2 细胞使用含有10% FBS的RPMI1640王人备培养基分离、纯化、培养和传代大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)。脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自中国科学院细胞库(中国上海)。
1.3 分组情况MSC三维培养组和HUVEC三维培养组：96孔细胞培养板中每孔加入100 μL 1.5%(质地体积分数)的琼脂糖溶液，待其凝固。折柳将MSC和HUVEC消化、重悬、计数，制备为0.75×104/mL的MSC细胞悬液和0.25×104/mL的HUVEC细胞悬液，然后折柳将100 μL细胞悬液接种到琼脂糖细胞培养板中，培养48 h。
MSC/HUVEC成球共培养组(未处分组)：制备1×104/mL的搀杂细胞悬液(MSC和HUVEC的细胞数目比为3 ∶1)。将100 μL搀杂细胞悬液接种到琼脂糖细胞培养板中，相似条目下培养48 h。
CytoD处分组：MSC/HUVEC搀杂细胞悬液中加入微丝解聚试剂CytoD(责任浓度为500 nmol/L)，然后接种到琼脂糖细胞培养板中培养48 h。
1.4 共培养细胞球三维重建使用4%多聚甲醛溶液固定细胞球样品1 h后，浸润在PI染色责任液中，避光染色30 min，使用PBS溶液清洗3次，再使用DAPI溶液(以1 ∶1 000体积比稀释)避光染色细胞核15 min。使用PBS清洗3次后，使用激光共聚焦显微镜(LSCM，Leica，好意思国)对共培养细胞球进行三维重建。
1.5 细胞膜染色后共培养共培养前，使用细胞膜绿色荧光染色试剂盒(DiO)对MSC进行染色，使用细胞膜红色荧光染色试剂盒(DiI)对HUVEC进行染色，屡次清洗去掉过剩染料。按前述方法将染色后的细胞制备成MSC/HUVEC共培养细胞球，于LSCM下进行不雅察。同期，将100 μL相似搀杂细胞悬液接种到正常96孔细胞培养板中培养48 h，使用特殊荧皎洁微镜进行荧光不雅察。
1.6 TNTs的平直不雅察固定后的共培养细胞球使用鬼笔环肽染色试剂盒进行F-actin染色。惟一餍足以下条目的细胞间纠合结构才能判定为TNTs：①主要构成要素为F-actin；②延长轴直径变化较小；③可允许细胞质要素(如线粒体、钙离子、卵白质等)在细胞间滚动[17]。
将共培养细胞球汇集于1.5 mL EP管中，离心后将细胞球样品送至电镜室进行后续处分。使用场辐射扫描电镜(SU8010 FE-SEM，Hitachi，日本)进行图像采集。
1.7 TNTs的定位固定后的共培养细胞球样品在0.2% Triton X-100中过夜处分。清洗后室温下禁闭细胞2 h。样品用抗CD31一抗(以1 ∶300体积比用0.1% Triton X-100溶液稀释)在4 ℃下孵育过夜；随后用相应二抗(以1 ∶300体积比稀释在PBS溶液中)孵育样品2 h。临了进行鬼笔环肽染色，再使用DAPI溶液(以1 ∶1 000体积比稀释)染色15 min。
此外，在进行细胞球制备前，使用PKH26细胞膜染色试剂盒对MSC进行标记。同期，使用mGFP-腺病毒感染HUVEC。随后按前述方法制备共培养细胞球进行鬼笔环肽染色，临了使用LSCM进行不雅察。
1.8 线粒体的双向滚动共培养前，使用pHBmTur-Mito腺病毒感染MSC，标记其胞内的线粒体；使用mGFP-腺病毒感染标记HUVEC。随后制备成共培养细胞球，不雅察线粒体的移动轨迹。
接着不雅察线粒体在细胞间能否反向通顺。折柳使用pHBmTur-Mito腺病毒感染HUVEC标记其胞内的线粒体，使用mGFP-腺病毒感染标记MSC。共培养细胞球制备方法同前，于LSCM下不雅察。
1.9 线粒体膜电位的检测根据诠释书，使用线粒体膜电位检测试剂盒对未处分细胞球组和CytoD处分细胞球组进行JC-1染色，然后使用分光光度计进行光密度值(OD)检测。线粒体膜电位(相对OD值)=JC-1单体光密度值(激勉波长488 nm)/JC-1团聚物光密度值(激勉波长561 nm)，当线粒体膜电位缩短时，该比值加多。
1.10 小管造成实验汇集三维培养的细胞，加入适量胰卵白酶消化，随后接种到Matrigel基质胶涂层细胞培养板中(MSC/HUVEC成球共培养组和CytoD处分组每孔2×104个细胞，MSC三维培养组每孔1.5×104个细胞，HUVEC三维培养组每孔0.5×104个细胞)，在37 ℃、5%CO2条目下赓续培养。
制备密度和细胞比例同前的搀杂细胞悬液，将100 μL搀杂细胞悬液接种到正常96孔细胞培养板中培养48 h，随后消化、重悬、计数，接种到Matrigel基质胶涂层细胞培养板中(每孔2×104个细胞)，相似条目下培养。
同期，将未经胰卵白酶处分的共培养细胞球(未处分组、CytoD处分组)平直滚动到Matrigel基质胶涂层细胞培养板中(每孔2个细胞球状体)，在相似条目下赓续培养。特殊显微镜下对小管造成进行不雅察，使用Image J软件对图片闭幕进行分析。
1.11 β-catenin卵白免疫荧光染色将各组细胞样品进行固定，如前所述使用0.2% Triton X-100溶液处分后进行血清禁闭。然后将各组样品与一抗(抗体稀释体积比为1 ∶200)在4 ℃下孵育过夜。清洗后将细胞球样品与对应二抗(抗体稀释体积比为1 ∶300)在室温下孵育2 h，然后用DAPI溶液染色15 min进行不雅察。
1.12 Western blot检测制备同前的搀杂细胞悬液，将2 mL搀杂细胞悬液接种到正常6孔细胞培养板中贴壁培养48 h。各组细胞球样品和贴壁培养细胞样品清洗后加入适量RIPA裂解液，随后滚动至1.5 mL EP管中， 以400×g，离心15 min，汇集上清液。加入适量上样缓冲液，金属浴100 ℃，加热10 min。使用试剂盒配胶完成后按各组上样量20 μL上样，进行SDS-PAGE卵白电泳，使用5%脱脂奶粉禁闭2 h。然后敷一抗(抗体稀释体积比为1 ∶1 000)4 ℃过夜，第2天神用TBST洗膜3次，每次10 min，敷二抗(抗体稀释体积比为1 ∶6 000)室温2 h，再使用TBST洗膜3次，每次10 min，临了采集图像。
1.13 统计学分析选拔SPSS 19.0统计学软件进行分析。计量贵府以x±s默示，组间比较选拔t实验。P＜0.05默示相反有统计学意念念。使用Graphpad Prism5软件画图统计图表。
2 闭幕 2.1 细胞球共培养体系的竖立与共培养组比较，单独使用MSC或HUVEC成球培养，细胞无法蚁集成球(图 1A)。三维重建闭幕表示MSC/HUVEC共培养细胞球的立体结构(图 1B)。细胞膜染色共培养闭幕表示，二维贴壁培养时，细胞各自增殖成团；在成球共培养组中不错不雅察到不同细胞间的膜性纠合，相互交流(图 1C)。
2.2 细胞球共培养体系细胞功能考据图 2A所示，贴壁共培养组、成球共培养组、HUVEC三维培养组和MSC三维培养组在成管成果上有相反。对48 h小管成形实验数据分析表示，与成球共培养组比较，贴壁共培养组、HUVEC三维培养组和MSC三维培养组在管腔纠合交叉点数(成球共培养组：83.00±4.16，贴壁共培养组：30.33±4.70，HUVEC三维培养组：42.67±8.41，MSC三维培养组：15.00±3.22；n=3)和小孔数(成球共培养组：19.67±1.20，贴壁共培养组：5.00±1.53，HUVEC三维培养组：6.67±1.33，MSC三维培养组：1.33±0.88;n=3)上均显耀减少(P＜0.05)。
免疫荧光闭幕表示，与贴壁共培养组比较，成球共培养组的荧光强度增强(图 2B)。斟酌到三维条目下细胞类似对荧光强度的影响，使用Western blot检测细胞内β-catenin的卵白抒发量(图 2C)，闭幕表示，成球共培养组的卵白抒发量(1.432±0.088，n=3)较贴壁共培养组(1.143±0.064，n=3)显耀加多(P＜0.05)。
2.3 细胞球内TNTs的考据由于TNTs的主要要素为F-actin，因此选拔鬼笔环肽染色的方法来阐发细胞球内TNTs的存在。如图 3A所示，在LSCM下不雅察到共培养细胞球内存在鬼笔环肽染色呈阳性的结构，平直将两头细胞物理纠合，这些细胞间突起的直径沿长轴变化较小，妥当过往研究中转头的TNTs的特征。因此，不错估计MSC/HUVEC共培养细胞球中不雅察到的这些含有F-actin的细胞间突起结构为TNTs。扫描电镜的闭幕也表示球内细胞间存在无间交的纠合结构，向两头延长至细胞膜(图 3B)。
2.4 MSC和HUVEC之间由TNTs物理纠合使用CD31免疫荧光染色对细胞球中HUVEC进行特异性标记，闭幕表示MSC(CD31-)和HUVEC(CD31+)间存在TNTs结构(图 3C)。此外，共培养前将这两种细胞折柳标记上不同荧光，球形共培养完成后闭幕表示MSC(红色)和HUVEC(绿色)之间有TNTs(紫色)存在(图 3D)。
2.5 MSC和HUVEC能通过TNTs进行线粒体交流光镜下不雅察表示，与共培养细胞球组比拟，CytoD处分组细胞球半径加多(图 4A)。通过腺病毒感染，在绿色荧光卵白(GFP)标记的MSC胞内不雅察到开始于HUVEC呈红色荧光的线粒体；CytoD处分组细胞球中MSC胞内的红色荧光减少(图 4B)。同期检测线粒体能否反向从MSC滚动至HUVEC胞内。如图 4C所示，MSC胞内的线粒体标记为红色，共培养后在绿色荧光卵白标记的HUVEC胞内不雅察到红色荧光，而CytoD处分组荧光共定位步地缩小。线粒体膜电位检测闭幕表示，与未处分组(0.632±0.048，n=5)比较，CytoD处分组细胞的线粒体膜电位(1.124± 0.132，n=5)显耀下跌(P＜0.05)。
2.6 细胞间线粒体交流对小管造成的影响如图 5A所示，未经胰酶消化时，与CytoD处分组比拟，未处分组细胞球内HUVEC向外迁徙和增殖的速率更快、范围更广；而经胰酶消化后赓续培养，与未处分组比拟，CytoD处分组造成的小管密度较低。对48 h的小管成形实验数据分析表示，与未处分组比较，CytoD处分组在管腔纠合交叉点数(未处分组：76.33±17.30，CytoD处分组：20.67±4.84，n=3)和小孔数(未处分组：19.67±6.23，CytoD处分组：1.00±16.17，n=3)均显耀减少(P＜0.05)。
2.7 细胞间线粒体交流影响β-catenin的卵白抒发和HUVEC功能如图 5B所示，与CytoD处分组比拟，未处分组细胞球的β-catenin卵白荧光强度增强。Western blot闭幕(图 5C)标明，CytoD处分组β-catenin卵白的抒发水平(0.211±0.002，n=3)较未处分组(1.198±0.028，n=3)显耀下跌(P＜0.05)。
3 研究血管化是组织再生历程中一个极遑急的轮番[18]，短少有用血管再生将导致重生组织无法取得充足养分物资，进而组织缺损成立失败[19]。因此，当今组织成立和再生研究鸿沟多将血管内皮细胞和MSC长入应用，减少细胞因养分短少所致的凋一火[20-22]。
以往研究多选拔传统二维贴壁共培养模子，不外该模子并不可精采还原细胞在生物体内的生理景色；与之比拟，细胞球三维培养模子能提供更妥当生物体内原生的微环境[9]。本实验闭幕标明单独对MSC或HUVEC进行三维培养的成果并不睬想；而进行共培养后一种细胞以另一种细胞为刺激中心，发生了更为紧密的细胞间交流，最终配合成细胞球，诠释不同细胞间的斗殴交流影响了细胞步履，这一历程也与胚胎发育历程中的细胞步履相似；在形式发生历程中，复杂的组织结构开始于细胞群，而这些细胞群的生物学步履主要受细胞交流的主宰，从而决定细胞的糊口、增殖和分化等运谈[23]。
本实验闭幕也标明，相较于贴壁共培养景色，HUVEC在经过与MSC的球形共培养后，其细胞功能得到改善。β-catenin在HUVEC的黏附、增殖和迁徙中阐明着遑急作用，与血管造成密切计划[24]。缩短HUVEC胞内的β-catenin卵白活性，可使细胞数目减少、增殖速率放慢，血管造成受阻[25]。阻挠HUVEC内Src/Akt/β-catenin信号通路将导致血管生成减少[15]，而增强β-catenin信号通路转导则可促进HUVEC增殖和血管生成活跃[26]。而在本实验中，与传统二维贴壁培养模子比拟，细胞球三维培养模子显耀加多了共培养体系中的β-catenin卵白总量。因此，在立体三维空间中HUVEC和MSC间存在密切的功能交互作用，影响β-catenin卵白的抒发从而影响HUVEC功能。
当今，学者们多关怀MSC通过旁分泌[27]和外泌体[28]等波折机制对血管再生的影响，除此以外还存在以TNTs为代表的平直交领会谈[17， 29]。TNTs纠合仅在二维贴壁培养中得到考据，而关于在细胞球三维条目下不同细胞间的交领会谈是否为TNTs这个问题分析有限，抛弃了细胞球模子在组织再生和成立中的应用。本研究通过鬼笔环肽染色考据了MSC和HUVEC间以F-actin为骨架的TNTs纠合的存在，在三维环境下造成立体交流鸠集，为细胞提供了更多的交领会谈，更好地还原了细胞在生物体内的空间位置关系和共生关系，使两种不同的细胞通过这一桥梁紧密计划为一个举座阐明功能，而不单是只是简便的单分布细胞蚁集成团块。
TNTs当作细胞间的互动交领会谈可进行线粒体的转运[8]，而线粒体当作细胞能量开始，影响多种细胞行径[30-32]。HUVEC能经TNTs秉承来自于MSC的线粒体，从而缓解细胞凋一火，收复其增殖、迁徙和血管造成才调[29]。本研究也不雅察到线粒体在MSC和HUVEC间的双向交流互动，线粒体膜电位检测闭幕也标明TNTs能起到保管共培养细胞球线粒体膜电位的作用，而线粒体膜电位蜕变与细胞轮番性物化密切计划。因此，天然细胞球里面由于空间细密造成相对低氧环境，但TNTs介导的双向线粒体交流精采保管了细胞的活力，省略注重球体里面的细胞凋一火，从而保护细胞功能。本研究亦证实，当二维贴壁培养时TNTs造成数目减少，此外皮CytoD处分的CytoD处分组中也阻挠了部分TNTs的造成，而在这两种情况下均存在β-catenin卵白总量的下跌和HUVEC功能的蜕变。因此，共培养细胞球中TNTs系统的存在可能通过线粒体的双向交流影响β-catenin的卵白抒发，从而影响HUVEC的小管造收遵守。
本研究旨在构建一个更接近体内生理景色的MSC/HUVEC共培养细胞球研究模子，在体外实验中尽量还原细胞的原生微环境和立体交流鸠集，更成心于真切研究细胞间对话机制。同期，血管化是诈欺干细胞进行组织成立与再生的遑急轮番之一，本研究证实了TNTs介导的线粒体交流具有促进HUVEC成管功能的潜在才调，为更好地诈欺共培养细胞球及TNTs交领会谈改善细胞功能提供了新的念念路，为进一步制定计划营救计谋以达成更有用的血管化组织再生提供了初步表面凭据。
本研究也存在一定局限性，尽管体外实考据明TNTs能通过影响细胞间交流调控球内细胞活性和功能，但能否应用于体内实验还有待深究。由于TNTs短少特异性的构成要素，因此当使用CytoD当作阻挠剂时91porn。com，在阻挠了TNTs的同期也可能会阻挠细胞骨架；同期，由于干细胞具有多向分化潜能，共培养细胞球中的MSC是否发生了内皮细胞向分化进而影响成血管成果尚需真切研究。